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干货分享|蛋白酶K使用攻略来啦~

发布时间:2024/11/13浏览次数:340

蛋白酶K(Proteinase K)在这几年间走入大众视野,但在此之前的不少研究实验中,它已然是十分重要的存在。蛋白酶K,属于丝氨酸蛋白酶类,具有极高的酶活性和广泛的底物特异性。

在原位杂交技术中通常用于杂交前的样品处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,能增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号。在DNA提取中,主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白,使DNA游离在溶液中,随后用不同方法进行抽提,除去杂质,收集DNA。

 

图  蛋白酶K关键催化位点

蛋白酶K应用率较高,虽说其稳定性也很高,但在实际应用中,总会发现蛋白酶K不能带来很好的功效,如何用好蛋白酶K,希望本篇文章能够帮到正在实验中遇到问题的小伙伴们。

 

Q1:蛋白酶K的适配pH范围是多少?

A: 蛋白酶K在较广的pH范围内均有活性,金普诺安推荐pH范围为7.5-11.5。

 

Q2:蛋白酶K合适温度推荐是多少?

A: 推荐温度范围是37-70℃,70℃时活性处于顶峰。

 

Q3:干粉蛋白酶K如何配制?

A: 将蛋白酶K固体溶解于稀释缓冲液[20mM Tris-HCl(pH 7.4),1mM CaCl2,2%甘油]中,配制成20-40mg/ml溶液,在消化液或裂解液中添加蛋白酶K至终浓度为50-200μg/ml;蛋白酶K溶液若需反复使用,需分装保存,避免反复冻融。

 

Q4:蛋白酶K的储存条件?

A: 冻干粉可于4℃以下干燥环境中储存有效期3年;液体有效期1年,打开包装使用后,如果在2~8ºC环境下放置超过1周时间,建议过滤除菌,防止微生物污染。

 

Q5:干粉溶解后保存需要特殊的保护剂吗?

A: 溶解于稀释/储存缓冲液后,不再需要特殊的保护剂。

 

Q6:若实验样本为复杂样本,想要提取核酸,需要用蛋白酶K处理吗?

A: 推荐使用,如痰液、粪便类样本,可能存在可抑制PCR反应的物质(糖蛋白、免疫球蛋白等),及残留较多RNA酶。使用蛋白酶K可大程度灭活RNA酶,防止病毒RNA的降解,提高RNA回收率。

 

Q7:能否说下蛋白酶K的浓度对实验的影响?

A: 蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理,但若浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核的消失,从而影响杂交结果

而在DNA提取中,若蛋白酶K浓度过低,就会影响蛋白质的水解程度,导致提出的DNA含量和纯度都会受到影响。

 

Q8:蛋白酶K的抑制剂和激活剂有哪些?

A: 抑制剂:二异丙基氟磷酸(DIFP),苯甲基磺酰氟(PMSF);

    激活剂:1-5mM Ca 2+

Ca2+可以保护蛋白酶K不会自我降解、增加蛋白酶K的热稳定性、调节蛋白酶K的底物结合位点;对于难处理、需长期处理的样本(如运用于病毒保存液中时),因为处理时间较长,对蛋白酶K的钙离子依赖性有较大改进需求。

 

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结语:蛋白酶K应用广泛,包括且不仅限于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。以上为大家介绍的就是蛋白酶K在使用过程中的注意要点,在实验过程中与其接触会造成皮肤过敏反应,为了安全和健康考虑,使用时需务必穿好实验服,佩戴好防护手套和护目镜等进行操作。